Nội dung thi được thực hiện theo hướng dẫn nội dung dạy học các môn chuyên của các trường trung học phổ thông chuyên do Bộ Giáo dục và Đào tạo ban hành, áp dụng từ năm học 2001 – 2002.[4]

Trên thực tế, nội dung thi các môn khoa học tự nhiên đạt tới trình độ rất sâu (tương đương với các kiến thức ở bậc đại học) và gần như không liên quan đến kiến thức phổ thông. Ví dụ ở môn thi Hoá học, học sinh sẽ phải biết đến những kiến thức như cấu tạo chất, hoá phân tích,... là những kiến thức hoá học chuyên ngành ở bậc đại học. Sở dĩ nội dung thi như vậy vì để đáp ứng với yêu cầu chất lượng thí sinh tham gia thi các kỳ thi chọn đội tuyển Olympic khu vực và quốc tế, cũng như bước đầu cho học sinh làm quen với nội dung thi ở các kỳ thi lớn hơn.